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NEWS脱靶检测技术在918博天娱乐官网的应用探讨
来源:韦苑洁 日期:2025-03-02近年来,细胞和基因治疗(Cell & Gene Therapy, CGT)领域的发展取得了令人瞩目的进展。诸如anti-CD19和BCMA的多个CAR-T免疫细胞疗法在血液肿瘤的治疗中获得了成功,同时,基于AAV载体的基因疗法也为罕见疾病提供了新的解决方案。此外,CRISPR基因编辑技术的突破性进展更是为基因治疗开辟了新的时代,体外基因编辑疗法CTX001即将上市,而体内基因编辑疗法同样展现了良好的临床数据。然而,CRISPR技术的安全性问题引起了广泛关注,因其直接作用于基因组DNA,任何不精确的变更都可能带来长远的风险。因此,FDA等监管机构已提出了关于基因治疗安全性的指导原则,主要针对两个方面:一是基因组完整性的评估,包括染色体重排、大片段插入或缺失、外源DNA整合及其潜在致癌性;二是识别脱靶编辑活动,包括类型、频率和位置。
本文将详细介绍各种脱靶检测技术。脱靶效应(Off-target effect)是指在基因编辑过程中,CRISPR-Cas9等工具除了对目标序列进行编辑外,还可能错误地作用于其他与目标序列相似的非目标位点,导致基因组发生意外变化。为确保基因编辑的安全性和有效性,已经开发了多种检测和评估脱靶效应的方法。这些检测手段根据实验条件可分为两类:体内检测方法与体外检测方法。
体内检测方法指在活细胞或生物体内评估脱靶效应,这些方法更接近真实的生物学环境。
GUIDE-seq(Genome-wide Unbiased Identification of DSBs Enabled by Sequencing)是一种强大的工具,用于检测CRISPR-Cas9基因编辑系统的脱靶效应。其基本原理是通过引入一种双链寡核苷酸标记物(dsODN)插入由Cas9产生的DNA双链断裂(DSBs)位点,随后利用高通量测序技术全面识别这些被标记的位点。自推出以来,GUIDE-seq因其高效性和准确性获得广泛关注,迅速成为评估基因编辑特异性的标准技术之一。
优点:提供全基因组水平上的脱靶位点信息,直接检测体内真实的双链断裂事件,能够发现低频脱靶事件。
缺点:实验操作相对复杂,需要较高的技术水平,同时可能错过难以插入标记物的脱靶位点。
应用场景:基因治疗安全性评估、CRISPR工具优化、基础研究等。
DISCOVER-Seq(Disruption of Cas9 binding sites followed by sequencing)是一种创新性的方法,用于检测CRISPR-Cas9基因编辑过程中的脱靶效应。该技术通过监测Cas9与DNA结合位点的变化来识别潜在的脱靶位点。
优点:可以在活细胞中实时监控Cas9-DNA相互作用,提供非侵入式的检测手段,减少对细胞生理状态的影响,同时具有更高的特异性和准确性。
缺点:实验设计复杂,需求特定设备和技术支持;对于某些难以转染的细胞类型可能不适用。
应用场景:适用于基础研究到临床前试验的多个领域,包括评估新开发的CRISPR工具的安全性等。
体外检测方法是在实验室条件下进行的,使用从生物体提取的成分或合成材料进行测试,这些方法可提供对特定因素的精确控制。
Digenome-seq是一种高通量测序方法,用于全面检测CRISPR-Cas9基因编辑系统的脱靶效应。其原理是通过在体外使用纯化的基因组DNA模拟Cas9的切割作用,随后对消化后的DNA进行全基因组测序,以识别由Cas9造成的双链断裂位点。
优点:能够在全基因组水平上无偏见地鉴定脱靶位点,且相比计算预测具有更高的准确性。
缺点:可能遗漏在细胞内环境发生的脱靶事件,数据分析流程复杂,需要专业的生物信息学支持。
应用场景:用于验证新设计的sgRNA的特异性、评估基于CRISPR的治疗策略的安全性等。
除了上述几种方法,市场上还有如SITE-Seq、CIRCLE-seq、CHANGE-seq等多种脱靶检测技术,各具优缺点,适用场景广泛。每种方法的选择需要结合具体实验条件与需求。
总结来说,在不断发展的基因编辑技术中,如何准确评估和降低脱靶风险是未来研究的重要方向。我们期待更多高效、精确的脱靶检测手段的出现,以进一步提升基因编辑技术的安全性和可靠性。作为在基因治疗领域不断创新的企业,918博天娱乐官网致力于提供一站式基因编辑安全性评估服务,助力科学界在这一领域取得更大的突破。
凭借SGS认证、ISO9001质量体系认证和生物安全二级实验室资质,918博天娱乐官网持续为客户提供高效、安全的服务和产品。我们期待与广大科研团队合作,共同推动基因编辑技术的发展。
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